基于共价DNA锚定的近红外荧光生物传感器简析
半导体单壁碳纳米管（swcnts）是一种通用的近红外（nir）荧光团，其光电特性对化学环境非常敏感，因此被广泛用作构建各种生物传感器。在过去，研究人员通过表面活性剂、蛋白质或核酸的非共价吸附改造swcnts使其更适合生物传感，但非共价的修饰造成的复杂性限制了分析物结合的合理设计以及信号的转导。此外，将共价键不受控制地掺入swcnts的晶格会破坏nir荧光，“量子缺陷”已经被证明是一种不会破坏nir荧光的新型修饰方法。
近期，来自德国波鸿鲁尔大学（ruhr-university bochum）的sebastian kruss教授开发了“鸟嘌呤量子缺陷化学”这一swcnts传感器的改性策略，将单链dna（ssdna）锚定在swcnts表面并设计了用于细菌毒力因子和新冠病毒（sars cov-2）刺突蛋白的传感器，证明了该策略的合理性。研究成果以“near-infrared fluorescent biosensors based on covalent dna anchors”为题发表在j. am. chem. soc.期刊上。
研究人员为swcnts设计了一种新的共价表面改性策略（图1a），所使用的ssdna由两部分组成，即含鸟嘌呤的锚定序列(gt)15和不含鸟嘌呤的捕获序列t20。该策略的基本原理如下：通过鸟嘌呤将dna固定在swcnts的晶格上以减少非特异性运动，在玫瑰红（rb）处理以及15 min的绿光（25 mw）照射后将分子识别事件转化为特异性的近红外（nir）荧光变化信号。rb介导的单线态氧导致与鸟嘌呤量子缺陷结合相关的吸收和荧光光谱产生浓度依赖性增强（图1b），表明鸟嘌呤和swcnts的晶格发生了共价反应。
对于没有缺陷或鸟嘌呤缺陷密度低的单壁碳纳米管，添加互补核苷酸a20到swcnts的悬浮液导致swcnts荧光略有降低（图1c），而对于具有高鸟嘌呤量子缺陷密度的swcnts，添加a20降低了荧光，此外非互补序列t20或缓冲液对荧光信号没有明显影响（图1d）。以上结果表明，用鸟嘌呤锚定dna会降低非特异性荧光变化，18 μm rb引起的鸟嘌呤缺陷密度具有合适的锚定程度，可以减少非特异性扰动，同时保持杂交和信号转导能力。
图1 基于共价dna锚定的swcnts传感器的设计
为了优化捕获序列长度，研究人员测试了具有6、10和20核苷酸长捕获序列的swcnts传感器，相比之下短捕获序列（即6个碱基）之间的相互作用不会影响花菁染料cy3标记的寡核苷酸的各向异性（图2a），然而长度为20个碱基的寡核苷酸在各向异性中没有时间依赖性变化（图2b），结合互补序列的增加幅度，研究人员采用长度为20个碱基的寡核苷酸作为捕获序列。此外，研究人员发现在两种长度的锚定序列下，cy3标记的dna与互补序列相互作用的各向异性随着swcnts传感器浓度的增加而增加，并在swcnts浓度大于500 pm时饱和（图2c）。
图2 荧光各向异性测量swcnts上的dna杂交
随后，研究人员测试了不同识别单元是否可以通过swcnts上的捕获序列固定，选择了一种血红素结合适配体（heapt）作为模型来评估适配体的结合以及淬灭单元与适配体的添加/去除（图3a）。如图3b所示，添加血红蛋白适配体（在5’端具有a15序列用于杂交）和血红蛋白（he@heapt-a15）可使swcnts荧光猝灭高达57%。去铁胺b（dfo）和吡喃素是两种常见的细菌毒力因子，在加入它们进行测试时，dfo将荧光增加至75%，吡喃素将荧光增加至83%，且这种效应是浓度依赖性的（图3c）。
为了排除溶液中观察到的效应与聚集有关，研究人员在玻璃表面涂覆(gdt)15t20功能化的swcnts，然后加入he@heapt-a15和dfo，对于较大的swcnts簇和较小的分辨率有限的斑点，he@heapt-a15引起的猝灭以及dfo引起的荧光恢复都是清晰可见的（图3d）。
图3 识别单元的锚定和毒力因子的检测
最后，研究人员使用swcnts传感器测试了可作为许多疾病生物标志物的大分子——蛋白质，选择sars cov-2刺突蛋白作为模型。研究人员首先根据以往的研究选择sp34和msa52作为适配体，牛血清白蛋白（bsa）作对照，以如图4a所示的方式进行测试。如图4b ~ 4c所示，添加sars cov-2刺突蛋白会降低swcnts的荧光，这种效应仍与浓度相关，并且在浓度大于等于10 nm时饱和（图4d）。此外，随着时间的延长，与sp34相比，msa52构成的传感器荧光略有增加，在观察期间几乎保持稳定（图4e）。以上结果表明，msa52作为适配体的swcnts传感器适合sars cov-2刺突蛋白的检测。
图4 sars cov-2刺突蛋白的传感
总之，研究人员为swcnts传感器设计了一种新的共价表面改性策略，使其更适合生物传感。作者筛选了最佳的缺陷密度和捕获序列长度，使传感器在减少非特异性荧光的同时保持杂交和信号转导能力，并成功构建了用于细菌毒力因子和sars cov-2刺突蛋白的传感器。该策略在swcnts以及相似传感器的改性中具有广阔的应用前景。
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对于没有缺陷或鸟嘌呤缺陷密度低的单壁碳纳米管，添加互补核苷酸a20到swcnts的悬浮液导致swcnts荧光略有降低（图1c），而对于具有高鸟嘌呤量子缺陷密度的swcnts，添加a20降低了荧光，此外非互补序列t20或缓冲液对荧光信号没有明显影响（图1d）。以上结果表明，用鸟嘌呤锚定dna会降低非特异性荧光变化，18 μm rb引起的鸟嘌呤缺陷密度具有合适的锚定程度，可以减少非特异性扰动，同时保持杂交和信号转导能力。
图1 基于共价dna锚定的swcnts传感器的设计
为了优化捕获序列长度，研究人员测试了具有6、10和20核苷酸长捕获序列的swcnts传感器，相比之下短捕获序列（即6个碱基）之间的相互作用不会影响花菁染料cy3标记的寡核苷酸的各向异性（图2a），然而长度为20个碱基的寡核苷酸在各向异性中没有时间依赖性变化（图2b），结合互补序列的增加幅度，研究人员采用长度为20个碱基的寡核苷酸作为捕获序列。此外，研究人员发现在两种长度的锚定序列下，cy3标记的dna与互补序列相互作用的各向异性随着swcnts传感器浓度的增加而增加，并在swcnts浓度大于500 pm时饱和（图2c）。
图2 荧光各向异性测量swcnts上的dna杂交
随后，研究人员测试了不同识别单元是否可以通过swcnts上的捕获序列固定，选择了一种血红素结合适配体（heapt）作为模型来评估适配体的结合以及淬灭单元与适配体的添加/去除（图3a）。如图3b所示，添加血红蛋白适配体（在5’端具有a15序列用于杂交）和血红蛋白（he@heapt-a15）可使swcnts荧光猝灭高达57%。去铁胺b（dfo）和吡喃素是两种常见的细菌毒力因子，在加入它们进行测试时，dfo将荧光增加至75%，吡喃素将荧光增加至83%，且这种效应是浓度依赖性的（图3c）。
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图3 识别单元的锚定和毒力因子的检测
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图4 sars cov-2刺突蛋白的传感
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