基于微流控的电泳核酸浓缩技术
荧光检测是当下最灵敏的光谱检测技术之一，通过对光源调频可以选择激发跃迁的初始状态和终了状态，因此可以解析分子的十分复杂的谱带，与其他光谱法相比，其具有灵敏度高、适用性好等优点。然而，光学元件的小型化和光学配置是小型化荧光检测器发展的两大挑战。
据麦姆斯咨询报道，近期，来自上海应用技术大学的研究人员于《微纳电子技术》期刊发表论文，设计并制备了搭载荧光修饰核酸探omupy2-probe的微芯片的两种优化结构。第一种结构应用薄膜的光干涉效应，通过湿法腐蚀法制备石英薄膜，腐蚀过程中采用cr作为保护膜形成石英玻璃、石英薄膜和石英玻璃的三层结构，减少了原聚二甲基硅氧烷（pdms）层在波长400-500nm的背景荧光；第二种结构利用核酸的内容位点带负电，通过电泳的方式对核酸进行浓缩，并将au电极连接到200μm宽的流路的两侧，设置电极电压为0.1v，进行电泳浓缩实验。总之，该研究提出的两种优化结构弥补了原芯片在光学实验中和低浓度实验条件下的缺陷。
pdms层的改进
原芯片分为两部分，分别为具有高透光率和易于加工的pdms层组成的上部和具有优异紫外光透射率的石英玻璃层组成的下部。pdms材料可通过简单的方法用于构建各种模式的通道。然而，从迄今为止报道的实验中发现，在绝大多数pdms芯片中，pdms层会显示自发的高荧光，由于激发光的反射，荧光光谱的背景干扰会增强。
而石英具有独特的光学特性，且石英玻璃耐高温、热膨胀系数极小、化学热稳定性好，因此，在该研究中，研究人员采用石英替代了原芯片使用的pdms。但更替为石英无法完全抑制散射光反射，相反，石英玻璃可能因材质会使光学均匀性不稳定，并导致其荧光更加分散，从而使散射光再次激发，所以研究人员在制备过程中应用了薄膜的光干涉效应。具体来看，研究人员在由石英玻璃构成的流路层上添加一层由石英玻璃构成的薄膜，然后和下部的石英玻璃键合，构成石英玻璃、石英薄膜与石英玻璃的三层结构，如图1所示。薄膜制备和芯片制备流程图如图2所示。
图1 石英芯片三层结构示意图
图2 薄膜制备和石英芯片制备流程图
电泳浓缩核酸 在考虑了荧光检测芯片原材料的优化后，研究人员设计了一种电化学浓缩核酸的方法，以便在低浓度区域进行检测。此外，研究人员采用了两种电极使用方法：一种是电极从流路两端接入；另一种是电极从流路侧方接入。为了确认芯片能否进行核酸浓缩，使用制备的石英芯片，采用第一种电极接入方法，在微沟道中插入铂丝（pt）作为体电极来确认荧光标记的rna（浓度为1μmol/l）的电泳。体电极核酸浓缩示意图如图3所示。
图3 体电极核酸浓缩示意图
而第二种方法采用剥离工艺，以cr/al作为电极材料，制作了cr/al薄膜电极。电极从流路侧方接入，cr/al薄膜电极的制备流程图如图4所示。因在后续实验过程中出现了电极脱落的现象，研究人员将电极材料由cr/al改为au，制备流程与图4流程基本一致，实验示意图如图5所示，将au电极与微沟道相连接（图5（a）），然后用cu作为导电材料连接au电极，使用折射率为1.516的显微镜浸油和倍数100的物镜进行观察（图5（b））。
图4 薄膜电极制备流程图 图5 rna电泳示意图 进一步实验结果发现，当电极材质为au、电极电压在0.82v以下时，才能使电极不发生脱落，样品溶液不发生电解。当电极电压为0.1v、电泳时间达到80s时，核酸浓度比和荧光强度为最大值，核酸浓度比提高了约6.07倍，荧光强度提高了约2.28倍。综上所述，所制备的微芯片既能改善荧光背景误差，又能在低浓度样品下浓缩核酸，提高荧光强度。
图6 样品浓度为1μmol/l、电极电压为0.1v时不同电泳时间的荧光效果图
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而石英具有独特的光学特性，且石英玻璃耐高温、热膨胀系数极小、化学热稳定性好，因此，在该研究中，研究人员采用石英替代了原芯片使用的pdms。但更替为石英无法完全抑制散射光反射，相反，石英玻璃可能因材质会使光学均匀性不稳定，并导致其荧光更加分散，从而使散射光再次激发，所以研究人员在制备过程中应用了薄膜的光干涉效应。具体来看，研究人员在由石英玻璃构成的流路层上添加一层由石英玻璃构成的薄膜，然后和下部的石英玻璃键合，构成石英玻璃、石英薄膜与石英玻璃的三层结构，如图1所示。薄膜制备和芯片制备流程图如图2所示。
图1 石英芯片三层结构示意图
图2 薄膜制备和石英芯片制备流程图
电泳浓缩核酸 在考虑了荧光检测芯片原材料的优化后，研究人员设计了一种电化学浓缩核酸的方法，以便在低浓度区域进行检测。此外，研究人员采用了两种电极使用方法：一种是电极从流路两端接入；另一种是电极从流路侧方接入。为了确认芯片能否进行核酸浓缩，使用制备的石英芯片，采用第一种电极接入方法，在微沟道中插入铂丝（pt）作为体电极来确认荧光标记的rna（浓度为1μmol/l）的电泳。体电极核酸浓缩示意图如图3所示。
图3 体电极核酸浓缩示意图
而第二种方法采用剥离工艺，以cr/al作为电极材料，制作了cr/al薄膜电极。电极从流路侧方接入，cr/al薄膜电极的制备流程图如图4所示。因在后续实验过程中出现了电极脱落的现象，研究人员将电极材料由cr/al改为au，制备流程与图4流程基本一致，实验示意图如图5所示，将au电极与微沟道相连接（图5（a）），然后用cu作为导电材料连接au电极，使用折射率为1.516的显微镜浸油和倍数100的物镜进行观察（图5（b））。
图4 薄膜电极制备流程图 图5 rna电泳示意图 进一步实验结果发现，当电极材质为au、电极电压在0.82v以下时，才能使电极不发生脱落，样品溶液不发生电解。当电极电压为0.1v、电泳时间达到80s时，核酸浓度比和荧光强度为最大值，核酸浓度比提高了约6.07倍，荧光强度提高了约2.28倍。综上所述，所制备的微芯片既能改善荧光背景误差，又能在低浓度样品下浓缩核酸，提高荧光强度。
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