原生质体分离与体细胞杂交
原生质体分离与体细胞杂交
实验准备：
配置并过滤灭菌2%的纤维素酶和0.4%果胶酶；蔗糖22%的原生质体漂浮培养基；原生质体培养基；fda母液和工作液。
6.1 实验目的
掌握植物细胞酶解去壁方法；原生质体活力鉴定的方法；了解细胞杂交的基本程序和方法。
6.2 原生质体分离
实验材料：
烟草无菌苗叶片，烟草悬浮细胞系。
实验操作：
a. 取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/l甘露醇-cpw溶液中，置于4℃黑暗下预处理6-8小时；悬浮细胞置于4℃黑暗下预处理48小时。
b. 预处理的叶片用吸管吸去预处理液，悬浮细胞离心转入培养皿中，然后加入2％纤维素酶、0.4％果胶酶溶液，用封口膜将培养皿封严，置于暗处在24~26℃下保温酶解；
c. 在倒置显微镜下观察，细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解。用吸管轻轻压挤，以释放出全部原生质体；
d. 通过一个60~80μm的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管中，在100g下离心3min，使原生质体沉降；
e. 弃取上清夜，将沉降物缓慢加入含有cpw配制的860mmol/l蔗糖溶液的螺帽离心管中，在在100g下离心10min；
f. 将蔗糖溶液的上部原生质体带收集起来，并转入到另一个离心管中。在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮，在100g下离心3min，重复本相清洗过程至少3次；
g. 最后一次清洗之后，加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。将原生质体按讲授的方法培养。
6.3 原生质体活力与密度测定
a．取一小指形管（已灭菌），加入1ml刚分离的原生质体悬浮液，再在其中加入1-2滴fda工作液；
b．在血球计数板上滴一滴经fda处理的原生质体悬浮液，置于荧光倒置显微镜下观察。
c．根据发荧光细胞占总细胞的比例计算原生质体生活力，根据单位体积的细胞数计算细胞密度。
6.4 peg诱导细胞体融合
a. 将上述分离的原生质体密度调整为4×105/ml的原生质体悬浮液备用；
b. 在1个60×15mm的培养皿中滴1滴（2~3ml）硅液200，然后在硅液上面放一张22×22mm的盖片；
c. 将叶片原生质体和悬浮细胞原生质体等体积（一般各0.5ml）混合，然后用吸管吸取大约150μl原生质体悬浮液置于盖玻片上。静止大约5 min，以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层；
d. 然后在原生质体悬浮液中，加入等体积的peg溶液（50%peg1540，10.5mmol/lcacl2?2h2o，0.7mmol/lkh2po4?h2o）。室温（24℃）下，将peg溶液中的原生质体保温10~20 min.，在倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况；
e. 以5 min间隔轻轻加入2滴稀释液（50 mmol/l甘氨酸，50mmol/lcacl2?2h2o，300 mmol/l葡萄糖，ph9~10.5），保持5 min后，加入1滴原生质体培养基；
f. 用新鲜的原生质体培养基，以各为5 min的间隔，将原生质体清洗5遍，每次洗完之后，不要把盖片上的培养基全部去掉，要在原生质体上留下一薄层旧培养基，而将新鲜培养基加于其上。此时可在倒置显微镜下，根据叶绿体标记统计异核融合率；
g. 洗涤完成后在盖玻片上滴大约500μl原生质体培养基，在盖玻片周围以小滴形式再加入500~1000μl培养基，以保持培养皿内的湿度，封口后置于25℃黑暗条件下培养。
6.5 细胞电融合演示
通过实际操作，演示电融合的操作过程和细胞融合过程。
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a. 取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/l甘露醇-cpw溶液中，置于4℃黑暗下预处理6-8小时；悬浮细胞置于4℃黑暗下预处理48小时。
b. 预处理的叶片用吸管吸去预处理液，悬浮细胞离心转入培养皿中，然后加入2％纤维素酶、0.4％果胶酶溶液，用封口膜将培养皿封严，置于暗处在24~26℃下保温酶解；
c. 在倒置显微镜下观察，细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解。用吸管轻轻压挤，以释放出全部原生质体；
d. 通过一个60~80μm的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管中，在100g下离心3min，使原生质体沉降；
e. 弃取上清夜，将沉降物缓慢加入含有cpw配制的860mmol/l蔗糖溶液的螺帽离心管中，在在100g下离心10min；
f. 将蔗糖溶液的上部原生质体带收集起来，并转入到另一个离心管中。在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮，在100g下离心3min，重复本相清洗过程至少3次；
g. 最后一次清洗之后，加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。将原生质体按讲授的方法培养。
6.3 原生质体活力与密度测定
a．取一小指形管（已灭菌），加入1ml刚分离的原生质体悬浮液，再在其中加入1-2滴fda工作液；
b．在血球计数板上滴一滴经fda处理的原生质体悬浮液，置于荧光倒置显微镜下观察。
c．根据发荧光细胞占总细胞的比例计算原生质体生活力，根据单位体积的细胞数计算细胞密度。
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a. 将上述分离的原生质体密度调整为4×105/ml的原生质体悬浮液备用；
b. 在1个60×15mm的培养皿中滴1滴（2~3ml）硅液200，然后在硅液上面放一张22×22mm的盖片；
c. 将叶片原生质体和悬浮细胞原生质体等体积（一般各0.5ml）混合，然后用吸管吸取大约150μl原生质体悬浮液置于盖玻片上。静止大约5 min，以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层；
d. 然后在原生质体悬浮液中，加入等体积的peg溶液（50%peg1540，10.5mmol/lcacl2?2h2o，0.7mmol/lkh2po4?h2o）。室温（24℃）下，将peg溶液中的原生质体保温10~20 min.，在倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况；
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