微流控+拉曼光谱+机器学习实现蛋白质颗粒的智能鉴定
药品溶液中存在的颗粒或聚集体可能会引起免疫反应并影响产品安全性。随着越来越多的高浓度治疗性单克隆抗体（mab）产品的开发和推出，根据美国药典，在规格范围内需要控制亚可见颗粒水平，并且每个容器中粒径大于等于10 μm的颗粒不超过6000个，粒径大于等于25 μm的颗粒不超过600个。单克隆抗体在应力条件下容易降解（例如聚集、片段化和氧化），从而产生多种蛋白质颗粒。在制造和储存过程中存在多种应力条件，例如振摇、高温暴露、化学或光诱导氧化以及极端ph值等。因此，在足够长的保质期内，实现对亚可见颗粒物的控制，变得极具挑战性。除了确定亚可见颗粒的数量以外，准确有效地表征蛋白质颗粒并了解其可能暴露的应力条件，在制造和储存期间采取补救措施并实施颗粒控制策略，对延长产品的保质期至关重要。
据麦姆斯咨询报道，近期，复旦大学马炯教授团队和中国科学院长春光机所李备研究团队在talanta期刊上发表了题为“closed, one-stop intelligent and accurate particle characterization based on micro-raman spectroscopy and digital microfluidics”的论文。该研究提出了一种基于显微拉曼光谱技术和数字微流控芯片（dmf）对蛋白质颗粒进行智能表征的新方法，并且利用该方法以及机器学习模型成功地将多种应力条件下产生的蛋白质颗粒进行了分类，分类的精准度高于93%。
具体而言，在该研究中，研究人员提出了一种在dmf芯片上通过显微拉曼光谱对蛋白质颗粒进行智能表征的新方法。研究人员首先制备了八种应力类型诱导的蛋白质颗粒溶液，其中包括振摇、冷冻-解冻（ft10）、高温40°c、高温80°c、ph3振摇、ph10振摇、氧化振摇和2000 klh的光暴露。利用以上应力条件进行诱导之后，研究人员将每种颗粒溶液加载到dmf芯片上进行电流控制，并且基于一组预先设计的指令（例如，电压、持续时间、速度和顺序等）进行分液，分出的液滴体积约为100 nl。该研究中的dmf芯片的顶板由石英制备制成，以最大程度地减少拉曼背景噪声，获取的拉曼光谱数据用于开发各种机器学习算法模型，以预测应力诱导条件下引起的蛋白质颗粒的分类。
图1 蛋白质颗粒智能表征流程图 在该研究中，研究人员收集了不同应力条件下诱导产生的每种蛋白质颗粒溶液的220个拉曼光谱，并且选择波数为600 cm⁻¹~1800 cm⁻¹的拉曼光谱以用于数据预处理和机器学习分析，其中波数为1200 cm⁻¹ ~ 1700 cm⁻¹的拉曼光谱区域揭示了酰胺i、酰胺ii和酰胺iii的蛋白二级结构信息。在不同应力诱导条件下，8种蛋白质颗粒样品中的酰胺i、酰胺ii和酰胺iii的蛋白二级结构信息以及c骨架信息，呈现出不同的变化，利用机器学习方法可以很好的进行检测分类，分类精准度大于98%。
图2 蛋白质颗粒表征的拉曼光谱分析
图3 不同应力条件下形成的蛋白颗粒平均拉曼光谱及机器学习主成分分析
综上所述，该研究结合机器学习，开发了一种基于dmf的拉曼光谱颗粒表征分析方法，并成功表征和分类了8种应力诱导条件下的蛋白质颗粒。这种方法具有以下几个明显的优点。首先，封闭的dmf平台可以很好地防止样品制备和测试过程中的颗粒污染，以提高检测准确度。其次，它可以同时提供具有形态和化学结构信息的颗粒表征的一站式检测，以节省成本和时间并提高效率。此外，该方法仅消耗少量样品，并且dmf芯片上的颗粒液滴可以在拉曼测试后回收并重复使用，用于其他研究目的。最后，机器学习算法简化了复杂的拉曼光谱解析，并提供具有高分类精度的智能颗粒表征。这种新颖的颗粒表征方法可以极大地支持科学家确定颗粒形成的可能根本原因，并开发准确的数据驱动的颗粒控制策略，最终延长高浓度抗体产品在全生命周期管理期间的保质期。
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图1 蛋白质颗粒智能表征流程图 在该研究中，研究人员收集了不同应力条件下诱导产生的每种蛋白质颗粒溶液的220个拉曼光谱，并且选择波数为600 cm⁻¹~1800 cm⁻¹的拉曼光谱以用于数据预处理和机器学习分析，其中波数为1200 cm⁻¹ ~ 1700 cm⁻¹的拉曼光谱区域揭示了酰胺i、酰胺ii和酰胺iii的蛋白二级结构信息。在不同应力诱导条件下，8种蛋白质颗粒样品中的酰胺i、酰胺ii和酰胺iii的蛋白二级结构信息以及c骨架信息，呈现出不同的变化，利用机器学习方法可以很好的进行检测分类，分类精准度大于98%。
图2 蛋白质颗粒表征的拉曼光谱分析
图3 不同应力条件下形成的蛋白颗粒平均拉曼光谱及机器学习主成分分析
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