核酸脂质体纳米粒LNP的制备方法
核酸脂质体纳米粒lnp介绍及其制备方法
1. 什么是核酸脂质体纳米粒lnp
脂质体（liposome）最早在1961年由科学家alec douglas. bangham 和 r. w. horne在显微镜下发现。脂质体是由脂质分子组成的囊泡结构，其脂质双分子层形成疏水外壳和内部的水相空腔，兼具亲水和疏水特性。脂质纳米粒（lipid nanoparticle，lnp）是使用脂质形成纳米微粒的一种。在过去，科研人员通常使用脂质纳米粒直接包裹化学药物，在基因治疗领域，研究人员开始使用脂质纳米粒包裹核酸，如mrna、sirna、pdna等，称为核酸脂质纳米粒。
针对covid-19新型冠状病毒的mrna疫苗开发，从病毒序列到成功上市只用了短短一年不到的时间。这在从前是无法想象和实现的。在这次针对covid-19新型冠状病毒的mrna疫苗上，莫德纳(moderna)采用了自主开发的可电离脂质sm-102，而辉瑞和biontech则从acuitas公司获得了一种名为alc-0315的可电离脂质的许可。
mrna分子由于疫苗的关系为大众所认识，但是很多人却不知道mrna疫苗的幕后功臣，甚至可以说是整个机理的关键所在，是将mrna封装并且安全有效地送进机体细胞的脂质纳米粒（lipid nanoparticle，lnp）。从技术上来讲，核酸药物的研发主要有三个壁垒：第一个是原料端，包括mrna原料序列的筛选和修饰；第二个是递送系统；第三个是整个药物的生产工艺。目前采用微流控技术产生脂质纳米颗粒（lnp）， 将mrna包裹在lnp 纳米颗粒中，再进入人体, 是fda唯一批准上市的mrna传递技术，并且已经在世界各地注射上亿剂的mrna新冠疫苗中采用，其技术的安全性和有效性已经在这次全球的新冠疫情中得到验证。
2. 核酸脂质体纳米粒lnp的作用机理
在包裹核酸的脂质纳米粒配方中，起关键作用的是可电离脂质。例如onpattro中的dlin-mc3-dma（简称mc3），其pka值在6.3-6.5 之间，这个特性让它在血清的环境中表面电荷基本为中性，有利于细胞将带有核酸片段的脂质纳米粒整个吞进细胞内，形成胞内体（endosome）。 一旦进入细胞后，胞内体的酸性环境使电离脂质的头部质子化并带正电荷，从而与胞内体的内膜融合，释放目标核酸到细胞中发挥作用。
图1 核酸脂质体纳米粒lnp的作用机理
3. 核酸脂质体纳米粒lnp制备方法
最适合的技术还是采用微流控混合技术来制备核酸脂质纳米粒，该方法相对简便快速，条件温和，同时容易实现生产放大。微流控技术基本原理：将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后，将两相溶液注入制备系统的两条入口通道，一端是rna的水溶液，一端是脂质的乙醇溶液，通过两相的快速混合，完成核酸脂质纳米颗粒的合成。 改变流体注入速度和比率，可以控制脂质纳米颗粒的粒径大小。将各种脂质溶解在乙醇中，mrna溶于酸性水缓冲液中，将两相快速混合。通过稀释乙醇相，脂质的溶解度降低，在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒，同时高效包载mrna。再经缓冲液膜包超滤或者透析除去残留的乙醇，中和缓冲液的ph值。
4. 制备核酸脂质体纳米粒lnp的微流控芯片结构
利用微流控芯片技术制备核酸脂质体纳米粒lnp主要是实现充分的混合，常采用鱼骨结构。芯片中鱼骨结构区域使流经的液体产生混沌流动，大大提高了液体的混合效率，比传统的搅拌混合均一性好，从而在芯片的出口处快速产生均匀的流体。其中的鱼骨结构可以是凸起（如图2所示），也可以是凹陷（如图3所示），制备效果跟体系有关，其粒径大小主要跟流速比有关。
图2 鱼骨结构凸起
图3 鱼骨结构凹陷
目前高校研究所及部分公司客户尚处在核酸脂质体纳米粒lnp的配方开发阶段，常选用带鱼骨结构的pdms芯片进行研究，一方面是因为pdms材质的芯片加工周期短，成本低，另一方面是因为pdms芯片的特性使得实验参数更易获得。以下3款核酸脂质体纳米粒lnp制备微流控芯片是研究者经常使用的。
图4 zx-ls-11核酸脂质体纳米粒lnp制备芯片（鱼骨结构凸起）
图5 zx-ls-31核酸脂质体纳米粒lnp制备芯片（鱼骨结构凹陷）
图6 zx-ls-31p核酸脂质体纳米粒lnp制备芯片（鱼骨结构凹陷）
图7 鱼骨结构核酸脂质体纳米粒lnp制备芯片实物图（pdms微流控芯片）
5. 制备核酸脂质体纳米粒lnp的进样设备
中芯启恒恒压泵（压力驱动微流体进样仪）用于生成稳定无脉冲的液流，其响应时间短，适用于各种要求苛刻的微流体应用。压力控制器由计算机通过 usb 接口控制，使用中芯启恒 fluidiclab suite 软件，可以生成复杂的压力或流速曲线 ( 如正弦波，方波，三角波等 )。配套的中芯启恒fluidiclab suite 软件可记录并输出压力控制器产生的数据。
图8 中芯启恒恒压泵连接示意图
将压力控制器 1 通道与 4 mm pu 管一端连接，然后把连接储液池的 ptfe 管与流量传感器的“in”接口相连，流量传感器的另一端“out”连接 ptfe 管作为液体输出口，最终组装出设备如图1所示。其余3个通道的连接与之相同。进样原理是：以气推液，气体管在储液池页面以上，出液管在储液池液面以下，气体挤压液面，将液体从出液管挤出，实现进样操作。
5.1 恒压泵（压力驱动微流体进样仪）特点：
压力输出波动小于 0.02% ，响应时间 9 ms，无论恒流输出还是变流 速输出，均可应对自如。
卓越的性能：
1）内置压力传感器，高速 pid 控制，压力输出波动：< 0.02%
2） 响应时间：< 9 ms
3）可安装四个独立的压力输出通道 多种压力输出范围（0-0.2 bar，0-2 bar, 0-8 bar, -1-1 bar, -1-6 bar)，并可根据客 户要求定制
4）可设置恒流输出（需接流量传感器）和压力波形输出
5.2 压力控制器软件的使用：
图9中芯启恒恒压泵压力控制窗口
如图9所示，可以直接设置各通道的压力参数，每个通道的压力参数可以设置不同。
图10中芯启恒恒压泵压力控制设置窗口
如图10所示，用户可以设置实时压力的读取间隔，其最低设定值为 0.001s ( 实测读取时最短读取周期约为 0.02 s，低于此间隔的数据是重复的 )。备注信息，压力校准和同步增减系数设置（多路压力协同输出）也可以在此操作。
6. 制备的核酸脂质体纳米粒lnp的粒径范围
如图11所示，利用带鱼骨结构的微流控芯片制备的核酸脂质体纳米粒lnp平均粒径在142nm左右。
图11 制备的核酸脂质体纳米粒lnp的粒径范围
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图1 核酸脂质体纳米粒lnp的作用机理
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最适合的技术还是采用微流控混合技术来制备核酸脂质纳米粒，该方法相对简便快速，条件温和，同时容易实现生产放大。微流控技术基本原理：将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后，将两相溶液注入制备系统的两条入口通道，一端是rna的水溶液，一端是脂质的乙醇溶液，通过两相的快速混合，完成核酸脂质纳米颗粒的合成。 改变流体注入速度和比率，可以控制脂质纳米颗粒的粒径大小。将各种脂质溶解在乙醇中，mrna溶于酸性水缓冲液中，将两相快速混合。通过稀释乙醇相，脂质的溶解度降低，在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒，同时高效包载mrna。再经缓冲液膜包超滤或者透析除去残留的乙醇，中和缓冲液的ph值。
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4）可设置恒流输出（需接流量传感器）和压力波形输出
5.2 压力控制器软件的使用：
图9中芯启恒恒压泵压力控制窗口
如图9所示，可以直接设置各通道的压力参数，每个通道的压力参数可以设置不同。
图10中芯启恒恒压泵压力控制设置窗口
如图10所示，用户可以设置实时压力的读取间隔，其最低设定值为 0.001s ( 实测读取时最短读取周期约为 0.02 s，低于此间隔的数据是重复的 )。备注信息，压力校准和同步增减系数设置（多路压力协同输出）也可以在此操作。
6. 制备的核酸脂质体纳米粒lnp的粒径范围
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图11 制备的核酸脂质体纳米粒lnp的粒径范围
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